Westernblot

   |    2015年9月14日  |   文章  |    0 条评论  |    2729

实验概要

免疫印迹是一个用于蛋白质分析的常规技术,在电场的作用下将电泳分离的蛋白从凝胶转移至一种固相支持物,然后利用抗原—抗体的特异性反应,从蛋白混合物中检测出目标蛋白,从而定量或定性地确定正常或实验条件下细胞或组织中目标蛋白的表达情况。Western blot还可用于蛋白—蛋白、蛋白—DNA和蛋白—RNA相互作用的后续分析,作为一种廉价、便捷、可靠的研究工具,将与质谱和蛋白质芯片等技术一起在蛋白质组时代发挥重要作用

主要试剂

细胞蛋白抽提试剂盒、蛋白浓度检测试剂盒、预染蛋白质分子量标准、10×碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液、电转缓冲液、SDS-PAGE蛋白电泳液、10×TBST、Western封闭液、5 × SDS 蛋白上样缓冲液

主要设备

垂直电泳槽、电转印槽、电泳仪、PVDF转印膜

实验步骤

(1)准备蛋白样品
①裂解细胞、抽提蛋白。目前已经有很多试剂公司提供抽提细胞全蛋白和亚细胞组分蛋白的试剂盒,可根据实际需要选用。需要注意的是,裂解液中务必要加入蛋白酶抑制剂合剂(protease inhibitor cocktail),以防止蛋白降解;如果提取的是磷酸化蛋白,则还要加入磷酸酶抑制剂合剂 (phosphatase inhibitor cocktail)以防止磷酸化蛋白降解。
②收集完蛋白样品后,为确保每个蛋白样品的上样量一致,需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同,需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。可根据实际需要选择商品化的与抽提蛋白试剂盒配套的蛋白浓度测定试剂盒。(2)SDS-PAGE
1)SDS-PAGE凝胶配制
SDS-PAGE凝胶可以参考《分子克隆实验指南》进行配制。目前许多试剂公司也提供了商品化的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒,为研究人员提供了更便捷的实验操作。
2)样品处理
①在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS- PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
②100℃或沸水浴加热3~5 min,以使蛋白充分变性。
3)上样与电泳
①按垂直电泳槽使用说明书将制好的SDS-PAGE胶版组装在电泳槽上,注好1×SDS-PAGE蛋白电泳液。注意不要漏液。
②拔掉凝胶上的梳子,用力要均匀,避免上样孔扭曲。
③蛋白样品冷却到室温后,用微量注射器或移液器把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内。为了便于观察电泳效果和转膜效果,以及判断蛋白分子量大小,有一个加样孔加入预染蛋白质分子量标准。
④接通垂直电泳槽电源,开始电泳。
注意:通常样品还在浓缩胶部分时,建议使用低电压恒压电泳;而在样品(溴酚蓝指示)进入分离胶时,建议使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置,低电压可以设置在80~100V,高电压可以设置在120V左右。
为了电泳方便起见,也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式,通常把电压设置在100V,然后设定定时时间为90~120 min。设置定时可以避免电泳时间过长使目的蛋白跑出SDS-PAGE胶。
⑤通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳,或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况,预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。

电泳中常出现的现象及原因

现象 原因
︶条带呈笑脸状 凝胶不均匀冷却,中间冷却不好
︵条带呈皱眉状 可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,或者两边聚合不完全
拖尾 样品溶解不好,或含盐
纹理(纵向条纹) 样品中含有不溶性颗粒
条带偏斜 电极不平衡或者加样位置偏斜
条带两边扩散 加样量过多

(3)转膜
转膜有湿转和半干转法,这里着重介绍湿转法。
①用塑料板轻轻地将两块玻璃板撬开,这个过程可以在电转缓冲液中进行,能有效防止胶破损。
②将凝胶上的浓缩胶和没有点样的孔道切去,根据剩余胶的大小准备3~4层滤纸2份和PVDF膜一张,PVDF膜适当大于滤纸或者胶。
③将凝胶、滤纸和海绵浸泡于电转缓冲液中10~30 min,PVDF膜先置于甲醇中处理10 s,然后浸于电转缓冲液中10 min。
④在电转夹上从负极向正极按次序放置:海绵—滤纸—凝胶—PVDF膜—滤纸—海绵
注意:务必用玻璃棒小心排尽凝胶和PVDF膜之间的气泡。
⑤电转夹夹紧后放入电转槽中,把电转夹的负极对着电转槽的负极,加满电转缓冲液。
⑥把电转槽放到装满冰的盆中,接通电流,条件为200 mA恒流2 h。
注意:在不同的实验中,应根据具体蛋白适当调整转膜条件,例如对70 kD以上的蛋白须适当延长转移时间。
⑦电转结束后用镊子取出PVDF膜。
(4)抗体杂交与显色
①封闭:用Western封闭液于室温处理PVDF膜1 h,在脱色摇床晃动。
②一抗反应:在Western封闭液中加入一抗(稀释倍数参照一抗说明书),在4℃下反应过夜。内参一般用a-TUBULIN的抗体(1:2000)。
③洗膜:用TBST洗膜3次,每次5~15 min。
④二抗反应:在Western封闭液中加入二抗(稀释倍数参照二抗说明书),室温孵育2 h。
⑤洗膜:用TBST洗膜3次,每次5~15 min。
⑥显色:根据二抗所偶联的酶,选择显色方法。

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