Western blot 转膜及膜的选择

   |    2015年12月11日  |   方法经验  |    0 条评论  |    4227

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转膜
经过 PAGE 电泳分离后的蛋白质样品需要经过“转膜”步骤——从 PAGE 胶转移到膜上固定,才能用各种方法进行 Western Blot 的检测和显色,而且为 了防止没有电场的情况下已经分离的蛋白条带扩散,转移要尽快进行转膜的首要 是选膜。在转移膜上显色其实就像是画家在画布上作 画一样,不光要有好的画 笔和颜料,适合的画布也是相当之重要。Western Blotting 亦是如此,没有选 择好合适的转移膜是无法做出漂亮的结果的。因此,选择适合的转移膜,要让转 移“膜”高一尺,帮衬而不是阻碍到我们的实验。
Western Blot 印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜(Nitrocellulose Blotting Membranes,NC)和 PVDF 膜(Polyvinylidene-Fluoride) ,此外也有用尼龙膜、DEAE 纤维素膜做蛋白印迹。具体哪种膜适合于哪些实验呢?选择 的根据主要有:a.膜与目的蛋白分子的结合能力(也就是单位面积的膜 能结合 蛋白的载量),以及膜的孔径(也就是拦截蛋白的大小);b.不影响后续的显色 检测(也就是适和用于所选的显色方法,信噪比好);c.如果后继实验有其他 要求,比如要做蛋白测序或者质谱分析,还要根据不同目的来挑选不同的转移膜, 就像国画要选择宣纸,油画要挑亚麻布或薄棉扣布一样。
转膜 是对 western blot 最终结果影响最大的一步,转膜质量的好坏直接决定了 实验结果的好坏。转膜的影响因素不多,主要有膜的选择、转印方法和实验操作三个方面。
首先是膜的选择问题。
膜的选择主要从实验目的和实验要求来考虑。例如,要做分子量小于 20kDa 的小蛋白,0.45um 的 NC 膜是不可取的,因为这样可能会使得蛋白因透过膜孔而造成膜结合的目的蛋白量不确定,从而影响到最终结果的可靠性。而如果所分离的蛋白需要进行测序,则非 PVDF 膜不可,因为只有 PVDF 膜才能经受住严酷的清洗条件。常用的 western blot 用膜有 NC 膜、PVDF 膜和 尼龙膜,它们的一些主要的特点总结如下表:

其次是转膜方法的选择。
主要有半干法转膜和湿法转膜。半干法操作要求高,但 效率也高。湿法操作要求相对低,花时间多一些。
最后是实验操作方面的问题。
使用 PVDF 膜的时候需要进行预处理,这里面会带 来一些问题,如甲醇润湿不够,膜的有些区域不能很好的结合蛋白就会引入误差。 膜上面一定不要有油脂类的东西,否则也会影响蛋白结合和抗体的杂交。
1. 硝酸纤维素膜
硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质,对蛋白有很强的结合能力,而 且适用于各种显色方法,包括同位素,化学发光(Luminol 类)、常规显色、 染 色和荧光显色;背景低,信噪比高。NC 膜的使用也很简便,比如不需要甲醛预 处理,只要在无离子水面浸润排出膜内气泡,再在电泳缓冲液中平衡几分钟就可 以 了;比如 NC 膜很容易封闭,也不需要特别严谨的清洗条件。转移到 NC 膜上 的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间, Schleicher & Schull 公司的 一个实验表明,转移到 NC 膜上的几种蛋白 4 度条件下保存 5 年依然保持免疫识 别特性,依然可以得到清晰可信的 Western Blot 结果。不过要注意的是纯的硝 纤膜在比较脆,又容易卷,操作要小心,不适合用于需要多次重复清洗的用途—— 因为经不起多次“折磨”。选择硝纤膜时要 注意的是选择合适的孔径,通常 20KD 以上的大分子蛋白用 0.45um 孔径的膜,小于 20KD 的话建议选择 0.2um 的, 如果小于 7KD 的话最好选择 0.1um 的膜。另外还要注意选择纯的 NC 膜——混有含醋酸纤维(CM)的 NC 膜结合力会有所降低。另外提醒一句:由于 NC 膜上结合 的蛋白会因为一些去污 剂而被代替,因此在封闭时最好使用较温和的 Tween20, 而且浓度不要超过 0.3%(据说 0.05%效果最好)。
2. PVDF 膜
刚开始做 WB 的人也许会有这种疑问:为什么实验室的老师(或者师兄师姐们) 在教我们做 WB 的时候,如果是用 PVDF 膜做,总是小心翼翼的剪,节省着用,甚至一些边边角角也舍不得丢掉呢?其实,这不仅是因为 PVDF 膜比较贵,还由于PVDF 膜是做 WB 的“杀手锏”。
聚偏二氟乙烯(PVDF)膜作为基质的转印膜由 Millipore 公司在 1985 年首 先推出。与硝酸纤维素膜相比,PVDF 膜在蛋白质截留能力,机械强度 和化学相容性上都更优越的性能(Pluskal,et al.,1986)。市售硝酸纤维素膜的典型结合量是 80-100μg/cm2,而 PVDF 膜结合量是 100-200μg/cm2(而结合强度 PVDF 比硝纤膜强 6 倍!)。在艾滋病毒(HIV)血清学检验中直接比较 PVDF 和硝酸纤维 素膜,PVDF 膜具有更好的截留总 HIV 抗原能力并提高抗体检测糖基化被 膜抗原 的性能。但是 PVDF 膜最大的优点不仅于此:更好的机械强度和化学耐受性使 PVDF 膜在各种染色应用和多重免疫检测中成为理想选择;而且单个凝胶的 泳道复本 可用于多种目的,如考马斯亮蓝染色后切出条带并进行 N-末端测序、蛋白消化/ 肽分离/内部测序和免疫检测(Kurien,et al.,2003)。特别是需要做 N 端蛋白测 序,在相当“严酷”的清洗条件下,当尼龙或者硝纤膜已经降解的情况下 PVDF 膜依然保持本色,笑傲江湖。所以 PVDF 也是要做蛋白测序的唯一选择。此外, 个人经验,一些强疏水蛋白用 PVDF 膜效果会更好一些。PVDF 膜适用的检测方法 也不少,化学发光、常规显 色、同位素和标准染色都一样 OK,但不适合荧光。 PVDF 膜特别注意的是需要 100%甲醇预处理(不超过 15 秒)再用缓冲液平衡,才 能用,而且适用过程中 万一干了也要同样程序再处理(不过要真出现这种问题 也是自己欠扁,谁要你不小心呢,转膜前处理也就罢了,转膜后再这样处理可能 会影响后继的抗体识别呢)。PVDF 膜同样分 0.45um 和 0.2um 的,后者孔径小, 对小分子蛋白有较好的拦截吸附,背景可能会比前者稍高。
3. 尼龙膜
尼龙膜更多是用于核酸的转移,也有见于蛋白印迹,比如 dot blot,比较于 NC 膜来说,它的优点是结合力强,特结实又柔软且不易卷曲,机械强度大,便于操 作,缺点是背景高——由于尼龙膜电荷密度高,使得非结合区 的封闭比疏水性 NC 膜困难,对于灵敏度高的检测方法,背景问题尤为突出(据分子克隆 III 说 通过热处理的酪蛋白和 1%聚乙烯吡咯烷酮延长封闭时间可以改 善),而且当转 移缓冲液中存在有 SDS 时蛋白质就容易从尼龙膜上泄漏(通过甲醛固定可以缓解 这一情况)。另外至今也没有适合尼龙膜上的直接染色方法。因此 在许多情况 下实验室人员进行 WB 实验不选择尼龙膜。
尽管如此,一些产品却能“取其精华,去其糟粕”,将尼龙膜一些不利于蛋白印 迹的因素缩小或者去除,使其成为有效的蛋白转移介质。比如说,化学发光底物 做得 相当出色的 Pierce 公司,其旗下的 Biodyne A&B Nylon Transfer Membrane 就是这样一个产品。这种分为 A,B 两型的尼龙膜做工精良,孔径大小一致,为 了保有尼龙膜高灵敏度的优点和摒弃背景影响大的缺 点,Biodyne 采用了合适 的 signal-to-noise 比例来调整,从而达到了 200ug/cm2 的蛋白结合能力,同 时有比大多数尼龙膜甚至比一些 NC 膜都要小的低背景。除此之外,B 型的 Biodyne 对于一 些带负电蛋白是一种理想的转移膜,因为它在 A 型的基础上提高了正电 荷集团的浓度。另外 Biodyne 相对于 NC 膜来说还是一种“打不怕,撕不烂,烧 不着 (200℃一下)”的“顽强”的转移膜。
Rockland Western Blot实验试剂总汇:
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