HBV复制指标检测

   |    2016年1月3日  |   方法经验  |    0 条评论  |    4174

HBV pgRNA的检测:

(1)将1ml Trizol加入到转染细胞或者米粒大小的组织标本中,室温放置5min,使细胞充分被裂解,然后收集到1.5ml的EP管中。

(2)每管加入200ul的氯仿,充分颠倒混匀15s,室温孵育2-5min。

(3)将其放入4℃离心机中,12000rpm,离心15min。

(4)离心后混合物将会出现分层现象,分为三层:底层是氯仿层,中间层是DNA和蛋白质的白色云雾层,上层是水相层含有RNA。

(5)将上层水相小心移至灭菌的经过DEPC处理的管中,注意不要吸到白色云雾部位。

(6)加入500ul的异丙醇,充分颠倒混匀,置于室温孵育10min。

(7)然后4℃,12000rpm,离心15min。离心后,小心吸弃上清,在EP管底部形成的白色沉淀即为RNA。

(9)加入75%的DEPC乙醇1ml,上下颠倒6-8次,然后4℃,12000rpm,5min离心。

(10)吸弃上清,置于室温充分干燥沉淀。

(11)加入1%DEPC水30ul溶解沉淀。

(13)Dnase酶去除RNA中基因组DNA的污染(Thermo scientific #EN0521),方法如下:

1)将下列反应液依次加到1.5ml的EP管中,37℃水浴30min

RNA                                  2ug

RNase-free/ DNase I                      2ul

10×RNase inhibitor buffer                2ul

DEPC水                               up to 20ul

2)每管中加入50mmol/ul的EDTA 2ul,65℃、15min终止反应。

3)检测所取RNA样品的浓度和纯度进行逆转录实验。

(14)使用TOYOBO逆转录试剂盒按照说明书进行逆转录。取14ul的RNA消化液在65℃水浴锅内温浴5min,然后立即放于冰上冷却。

配置反应液

RNA消化液          14ul

5×RT buffer         4ul

Primer Mix          1ul

RT Enzyme Mix      1ul

然后震荡混匀离心

 

逆转录反应

37℃     15min

98℃     5min

此反应产物结束后即获得cDNA,将cDNA于-20℃保存。

使用pgRNA引物进行PCR检测:引物位于病毒聚合酶基因启动区,该位置不能扩增2.4Kb,2.1Kb和0.7Kb的mRNA如图所示

pgRNA引物序列如下:230bp  60℃ 45s  30cycle

F(PGP1):5′-CTCAATCTCGGGAATCTCAATGT-3′

R(PGP2):5′-AGGATAGAACCTAGCAGGCATAAT-3′

 

 

 

 

HBV cccDNA的检测:基因组DNA的提取(按照TIANGEN试剂盒步骤)

(1) 转染细胞经胰蛋白酶消化,或者米粒大小组织标本用研磨棒进行充分研磨,PBS洗涤一次,然后再次加入PBS吹打细胞使其为细胞悬液,收集到1.5mlEP管中,12000rpm,离心1min,吸尽上清,每个EP管加200ulGA缓冲液振荡至彻底悬浮。

(2)每管加入蛋白酶K溶液20ul,颠倒混匀(若是组织,则需56℃,过夜)。

(3)每管加入GB缓冲液200ul,使其颠倒混匀,70℃水浴10min。

(4)每管加入无水乙醇200ul,在涡旋器上充分振荡15s。

(5)将上一步所得的溶液和絮状沉淀全部加入吸附柱CB3,12000rpm,1min离心。弃废液,然后将吸附柱CB3重新置于收集管中。

(6)向吸附柱CB3中加入GD缓冲液500ul,12000rpm,离心1min。弃废液,然后将吸附柱CB3重新置于收集管中。

(7)向吸附柱CB3中加入漂洗液600ulPW,12000rpm,离心1min。弃废液,然后将吸附柱CB3重新置于收集管中。

(8)重复操作步骤7

(9)将吸附柱CB3重新置于收集管中,12000rpm,离心2min。弃废液,然后将吸附柱CB3再次置于收集管中放于室温

(10)将吸附柱CB3放到一个新的1.5ml的EP管中,悬空向吸附膜的中间滴加30-50ulDDW,室温静置2-5min,12000rpm 离心2min,将溶液收集到EP管中。检测所得样品的浓度和纯度,可放于-20℃冰箱保存

(11)检测前,所得样品中需要加入Plasmid-safe TM ATP-Dependent DNase(PASD)酶(Epicentre)(此酶能够有效的降解非完整双链的DNA,提高HBVcccDNA的含量),反应步骤如下:

25mM ATP                              2ul

10×Reaction Buffer                       5ul

Plasmid-safe DNase(10U)                   1ul

DNA                                    1ug

DDW                                   up to 50ul

37℃ 水浴 1h,70℃ 水浴30min(目的是灭火此酶),保存于-20℃冰箱。进行real-time PCR检测,引物CCP1位于HBV DNA正链起始处上游,CCP2位于负链“缺克”下游位置,扩增片段跨越rcDNA双缺口,故HBV rcDNA很难被扩增而完整闭合的cccDNA可被高效扩增,如图所示:

 

HBV cccDNA 的引物:321bp  60℃  30cycle

F:5 TTCTCATCTGCCGGACCG 3’

R:5’CACAGCTTGGAGGCTTGAAC 3’

cccDNA定量检测标准品的制备:

HBVcccDNA在细胞内的含量较低,直接从细胞内抽提cccDNA难以满足实验中定量标准品的需要。HBV cccDNA与质粒均为共价、闭合、环状的双链DNA分子,因此我们使用含有1.1个copies HBV基因组的pcDNA3-HBV1.1质粒替代HBV cccDNA作为定量标准品,具体方法如下:

  1. 质粒首先用紫外分光光度仪在260nm波长下检测质粒总浓度(C ng/ul)及纯度
  2. 根据质粒DNA的分子量(M)及阿伏伽德罗常数(A)计算出质粒DNA的拷贝数(copies/ul=C×10-9/M´A),A=6.02´1023,用双蒸水进行10倍稀释为109-100 copies/ul 10个浓度梯度为标准品,做荧光定量PCR(以cccDNA的引物),建立cccDNA检测标准曲线。dsDNA的分子量M=碱基数×660,ssDNA的分子量M=碱基数×330,ssRNA的分子量M=碱基数×340
  3. 横坐标为质粒浓度的log值,纵坐标为相应质粒浓度的CT值,做标准曲线
  4. 将样品进行荧光定量PCR,求出其各自的CT值,将其带入标准曲线内,求出各自相应的log值,在将其进行反log,求出浓度,即copies/ul,

 

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