小实验,大细节——DNA抽提

   |    2015年10月9日  |   文章  |    0 条评论  |    1580

基因组DNA的抽提≠质粒DNA抽提

两者明明都是DNA抽提,为什么还要有不同的试剂盒呢?因为他们在实验原理上是不太一样的,其实关键在于这两者在实验的初始设计上就完全不同。

质粒抽提通常用的是碱裂解法,一般的试剂盒都会有Solution I,Solution II,SolutionIII,有的还会有SolutionIV,然后是过柱子。

 

拆开来讲,Solution I一般都是用来重悬菌液的,会加入RNase I,降解掉里面大肠杆菌的RNA。同时里面还会用Tris-HCl体系来维持一个pH,另外会加入较大量的EDTA,去螯合掉里面二价金属离子,使菌体本身的DNase失活。其实用双蒸水来代替Solution I问题也不大,关键就是把菌重悬起来就行。

 

然后是Solution II,一般来说主要成分有两个,就是NaOH和SDS,NaOH主要是用于破坏细胞膜结构,强碱条件下,菌体的细胞壁结构、细胞的磷脂双分子层和微囊结构的构相都会发生变化。而SDS在这里主要并不是起到裂解蛋白的作用,而是结合氨基酸,一般两个氨基酸可以结合一个SDS分子。菌体裂解后,其实小片段的质粒已经释放出来了,而大片段的基因组DNA还结合在蛋白质上。

 

结下来是Solution III,这都是一环扣一环的,SolutionIII的主要成分是醋酸/醋酸缓冲液。首先长时间强碱环境下,DNA会断裂,所以需要用醋酸进行中和,而钾离子可以与SDS产生沉淀反应,使可溶于水的十二烷基磺酸钠变成不溶于水的十二烷基磺酸钾。这样结合蛋白质的PDS就被沉淀下来了,同样基因组DNA也同样被沉淀了下来,用硅胶吸附释放在上清里的质粒,或者用无水乙醇对上清进行沉淀,即可获得质粒的DNA。

普通的基因组DNA抽提,首先是裂解,用离子型的蛋白变性剂:CTAB或者SDS对细胞进行裂解(加不加蛋白酶K其实并不太要紧),破膜的同时使得DNA从蛋白上解离下来。加入高盐溶液使蛋白质沉淀。然后用酚仿,使蛋白质沉淀变性在水相油相间,并分离出的可溶性蛋白。上清用异丙醇将DNA沉淀下来,同时低温加入一定量的一价阳离子,可加速DNA沉淀。

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