ELISA实验操作中常见问题

   |    2015年11月30日  |   方法经验  |    0 条评论  |    2319

转自【达科为生物城】

话说ELISA实验你知道多少呢?是不是也有许多困惑的地方呢?

下面我们为大家精心总结了下,ELISA实验操作中常见问题解答,你需要get哦

1、ELISA试验出现非常弱的结果,常见有7种原因,其解决方法如下:

1)可能原因:温育的时间或者温度不够;
解决方法:校正温育箱温度。
2)可能原因:显色反应时间太短;
解决方法:校正定时钟准确定时。
3)可能原因:所用配制缓冲液的蒸馏水有问题;
解决方法:使用新鲜合格的蒸馏水。
4)可能原因:加入抗体/酶的稀释液浓度太低;
解决方法:按照说明书保存试剂盒和准确配制工作液。校正移液器,吸嘴要配套,装吸嘴时要紧密。
5)可能原因:酶标仪滤光片不正确;
解决方法:检查酶标仪使用的滤光片。
6)可能原因:试剂盒没有充分平衡;
解决方法:试剂室温平衡至少20分钟,确保所有试剂已平衡至室温。
7)可能原因:不正确的试剂储存方式;
解决方法:按照说明书要求保存试剂盒。

2、试验的标准曲线和测定的重复性差,这是什么原因造成的?

答:试验的标准曲线和测定的重复性差,这是典型的由测定操作引起的问题,常见原因如下:
a)可能原因:加样本及试剂量不准;孔间不一致;
解决方法:校正移液器,吸嘴要配套,装吸嘴时要紧密。
重复某一样品时,加样时间尽可能与第一次接近;
重复测定标本,操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致,以排除这些因素造成的不一致的可能性;
样品稀释前应充分混匀。
b)可能原因:加样过快,孔间发生污染;
解决方法:重复测定标本,操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致,以排除这些因素造成的不一致的可能性;加样不要过快。
c)可能原因:加错样本;
解决方法:检查记录和试剂,是否加错样本。
d)可能原因:加样本及试剂时,加在孔壁上部非包被区;
解决方法:加样枪头不要贴壁。
e)可能原因:不同批号试剂盒中组分混用;
解决方法:不同批号试剂盒中组分不可混用。
f)可能原因:温育时间、洗板、显色时间不一致;
解决方法:检查时间是否一致。
g)可能原因:孔内污染杂物;
解决方法:离心样品,排除杂物。
h)可能原因:试剂/样品没有混匀;
解决方法:充分混匀样品和试剂。
i)可能原因:血清标本未完全凝固即加入,反应孔内出现纤维蛋白凝固或残留血
细胞,易出现假阳性反应等。
解决方法:待血清标本完全凝固后做试验。

3、 试验结果白板,而且阳性对照不显色,应如何分析和查找原因?

答:试验结果白板,而且阳性对照不显色,常见原因如下:
a)可能原因:漏加或者误加试剂;
解决方法:检查试验记录和剩余试剂。每次加液前均应核对标签。
b)可能原因:试剂过期;
解决方法:使用有效期内的产品。
c)可能原因:洗板液配制中出现问题,如量筒不干净含HRP酶抑制物(叠氮钠
等);
解决方法:使用干净的器皿,正确配制试剂。
d)可能原因:温育的时间或温度不够;
解决方法:校正温育箱温度。
e)可能原因:标准品失活或者丢失;
解决方法:标准品正确保存、溶解和混匀。
f)可能原因:抗体失活或者丢失;
解决方法:更换抗体或者提高抗体浓度
g)可能原因:酶失活或者丢失
检查方法:把工作浓度的酶再稀释20-100倍,取5uL加入50ul的显色底物,终止后显色是否能达到1.0左右,此为酶的粗略估计。
解决方法:更换酶或者提高酶的浓度。
h)可能原因:显色底物失活
检查方法:加少量的工作浓度的酶,TMB是否很快显色。
解决办法:更换显色底物。

4. 试验结果空白背景高,这是什么原因造成的?

答:试验结果空白背景高,常见原因如下:
a)可能原因:洗板不干净;
解决方法:充分洗涤,彻底拍干;洗板要防止交叉污染;浓缩洗液准确配制;吸嘴尽可能一次性使用;加样或加酶拍板的滤纸应弃去不用,不要反复使用,否则易造成污染。
b)可能原因:显色液变质或者试剂过期;
解决方法:检查试剂盒有效期。
c)可能原因:试剂稀释有误,如加酶的浓度过高;
解决方法:请按说明书所示稀释倍数配制;
d)可能原因:蒸馏水受酶等污染;
解决方法:使用新鲜蒸馏水;
e)可能原因:试剂混用;
解决方法:不同批号试剂勿混用。
f)可能原因:培养箱温度超过37℃或反应时间过长。
解决方法:显色反应时间适当缩短。

 

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