免疫共沉淀(Co-IP)

   |    2015年9月27日  |   方法经验  |    0 条评论  |    2646

实验概要:免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

实验原理:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。

主要试剂:1. RIPA Buffer配制:

基础成分:

Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)

NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)

NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液)

 

RIPA蛋白酶抑制剂

苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存)

EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH 7.4)

 

2. 工作液配制:

4.4gNaCl, 5mlNP-40, 50ml0.5mM Tris-cl, 50ml 0.5mM EDTA溶解于500ml双蒸水中,进行髙压灭菌放入4°C冰箱保存备用。蛋白酶抑制剂应该在使用当天同时加入

 

 

准备工作:

预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机

(1)将带有HA标签的HBx的表达载体用脂质体转染到HEK293细胞中(以HBx转293为例),6h后换成含有10%FBS的DMEM培养基,转染后48小时即可收获细胞,首先去除培养板中的培养基,用PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS.

(2)在每个孔中加入适量PBS,六孔板的三个孔细胞用细胞刮子刮下并收到一个EP管,12000g lmin 离心 ,去除上清。

(3)加入PIPA Buffer 与蛋白酶抑制剂的混合液(六孔板的三个孔细胞收到一个EP管中共加入400ul的混合液,PIPA Buffer与蛋白酶抑制剂加入的比例为100:1),在冰上裂解30min。

(4)4℃ 12000g  离心30min, 立即将上清收集到一个新的EP管中(取上清20u到另外的EP管中用来做western blot ,目的是为了验证HBx分子的转染效率)

(5)加入2ug 的一抗与相对应的对照IgG(Santa,normal rabbit IgG SC-2027,normal mouse IgG sc-2025 ),4℃过夜。

(6)过夜后加入约60ul的protein A+G agarose(Santa,sc-2002),在4℃摇床摇晃2-4h。

(7)4℃ 1000g 离心5min ,吸掉上清,用预冷的PBS洗涤珠子5次,每次加入1ml PBS洗涤(PBS提前预冷,并加入蛋白酶抑制剂),最后一次吸净PBS(可用镊子将200ul枪头压扁来吸PBS,这样做的目的是防止珠子损失)。

(8)每个样品用30ul 1×上样缓冲液将琼脂糖-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀缓冲液的量

(9)将上样样品煮5min以游离抗原、珠子,离心收集上清,上清液可以暂时存放于-20℃。

 

注意事项:

1. 细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40 或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的 cocktailer。

2. 使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用

3. 使用对照抗体:

单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗

兔多克隆抗体:正常兔IgG

4. 在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:

1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;

2) 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;

3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。

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